Author: User
Last saved by: Siesta
Company: и

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
Державна установа «Інститут харчової біотехнології та геноміки Національної академії наук України»

Цикл наукових праць
на здобуття щорічної премії Президента України для молодих вчених

 «Наукові основи Біоконверсії відходів АГРОПРОМИСЛОВОГО КОМПЛЕКСУ вищими грибами та використання її продуктів у функціональному харчуванні»

КРУПОДЬОРОВА Тетяна Анатоліївна – кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник лабораторії екстракції рослинної сировини та біоконверсії Державної установи «Інститут харчової біотехнології та геноміки Національної академії наук України»

АНТОНЕНКО Лариса Олександрівна – кандидат технічних наук, асистент кафедри промислової біотехнології Національного технічного університету України «Київський політехнічний інститут»

ДРЕВАЛЬ Константин Григорович – молодший науковий співробітник, асистент кафедри фізіології рослин біологічного факультету Донецького національного університету

2014

Актуальність роботи. 
Останні десятиліття характеризуються в Україні проблемами екології, у першу чергу – наслідками Чорнобильської катастрофи. Вони, а також економічні негаразди призвели до погіршення якості та структури харчування. Зменшилося споживання харчових продуктів – джерел енергії й повноцінного білка, вітамінів, макро- і мікроелементів. Внаслідок порушення обміну речовин багато людей страждають надлишковою вагою. Збільшилася захворюваність населення, зменшилась тривалість життя. Серед шляхів вирішення цієї надзвичайно важливої та актуальної для України проблеми – виробництво функціональних харчових продуктів, дієтичних добавок, харчових продуктів для спеціального дієтичного споживання та корекція раціону харчування з їх допомогою.
В розвинутих країнах світу кожен рік збільшується виробництво функціональних продуктів харчування – принципово нових продуктів з високою харчовою та біологічною цінністю, які здатні збільшувати функціональні ресурси організму людини, її працездатність, стійкість до факторів зовнішнього середовища. Розроблення таких продуктів в ряді країн здійснюється за державними програмами. Важливим етапом в створенні функціонального продукту харчування є вибір сировини, переважно рослинного походження, яка містить біологічно активні речовини, макро- та мікроелементи тощо. Найбільш поширеною основою таких продуктів, як показує світова практика, є вищі гриби. Перспективним напрямом сучасних мікологічних та біотехнологічних досліджень вважається створення наукових основ та розроблення технології отримання грибного міцелію (біомаси) їстівних та лікарських грибів та їх метаболітів із культуральної рідини. Біологічно активні речовини  вищих грибів та культуральної рідини відзначаються широким спектром терапевтичної дії: антибактеріальною, противірусною, антиоксидантною, гепатопротекторною, протипухлинною, антидіабетичною активністю, здатністю підвищувати імунітет, знижувати рівень холестерину, покращувати функціональний стан певних органів та систем  організму, зокрема – нервової, статевої, та сприяють профілактиці хронічних захворювань. Тому, вирішення проблем, пов’язаних із створенням функціональних харчових продуктів на основі вищих грибів, є вагомим внеском у вирішення вищезазначених гуманітарних проблем нашої країни та актуальним завданням дослідників. 
З іншого боку, актуальною проблемою залишається конверсія відходів, в тому числі – агропромислового комплексу. Ці відходи містять достатню кількість невикористаних біологічно активних речовин. Конверсія вирішує як екологічну проблему, так і проблему ефективного використання біоресурсів шляхом безвідходної переробки рослинної сировини.  Головною передумовою біоконверсії відходів є пошук ефективних об’єктів, перш за все целюлозолітичної дії, здатних до гідролізу різних матеріалів. Вищі гриби, особливо базидіальні ксилотрофи, відрізняються надзвичайно потужним ферментними комплексами, здатними до активного руйнування складних компонентів субстратів до простих молекул. Тому, позаклітинні ензими вищих грибів можна ефективно використовувати як біотехнологічний інструмент трансформації відходів. 
Метою даного циклу робіт було розроблення наукових основ біоконверсії відходів агропромислового комплексу вищими грибами та використання її продуктів у функціональному харчуванні. 
Для досліджень були вибрані представники вищих грибів різних таксономічних та екофізіологічних груп з відділів Ascomycota та Basidiomycota – 46 видів (157 штамів).
Результати проведених досліджень дозволили:
–	здійснити скринінг грибів на наявність позаклітинних ферментів, вивчити  ферментативний комплекс відібраних видів грибів, виявити види базидіальних грибів − активних продуцентів целюлозолітичних ензимів; 
–	розробити високоефективний спосіб отримання ферментних препаратів екзоцелюлаз та одержати, з високим ступенем очищення, 4 ензиматичні препарати целюлозолітичної дії; 
–	дослідити властивості отриманих ферментних препаратів із культуральної рідини базидіальних грибів, порівняти їх активність з комерційними аналогами; 
–	виявити для глибинного культивування досліджених видів грибів нові альтернативні субстрати – відходи агропромислового комплексу та встановити високу біологічну ефективність конверсії відібраних субстратів;
–	відібрати види грибів, перспективні для біотехнологічного застосування – конверсії відходів агропромислового комплексу та оцінити можливість використання цих відходів в якості субстратів для культивування грибів з отриманням багатих біологічно активними речовинами біомаси та культуральної рідини грибів;
–	вивчити закономірності росту культур вищих грибів за різних умов культивування та отримати нові дані щодо штамоспецифічних особливостей культур за такими показниками, як морфологічна характеристика колоній, радіальна швидкість росту вегетативного міцелію, життєздатність вегетативного міцелію; 
–	з’ясувати живильні потреби, значення кислотності живильного середовища, температури інкубування культур та отримати необхідні відомості щодо оптимальних параметрів культивування грибів; 
–	створити наукові засади та розробити технологію культивування на рідких середовищах (з відходами агропромислового комплексу) перспективних видів грибів – активних продуцентів біомаси;
–	дослідити біологічну цінність продуктів біоконверсії відібраними видами грибів та розробити рекомендації для використання біомаси та культуральної рідини їстівних та лікарських грибів Coriolus versicolor, Cordyceps sinensis, Ganoderma lucidum та Pleurotus ostreatus у функціональному харчуванні;
–	оцінити доцільність сумісного використання продуктів біоконверсії – біомаси та культуральної рідини відібраних видів грибів у функціональному харчуванні та дослідити стабільність біохімічного складу міцеліальної маси та культуральної рідини грибів в процесі тривалого зберігання; 
–	розробити рецептури функціональних продуктів харчування з використанням висушених біомаси грибів та культуральної рідини.
Оригінальні наукові результати. 
У досліджених видів грибів встановлено наявність ензимів, що обумовлюють метаболізм вуглеводів, ліпідів, азотних сполук та окисно-відновні процеси. Одним з важливих результатів скринінгу ферментативної активності грибів є вперше отриманні дані про здатність до синтезу позаклітинних ферментів грибами: Hohenbuehelia myxotricha, Lepista luscina, Lyophyllum schimeji, Phellinus igniarius, Piptoporus betulinus, Spongipellis litschaueri (амілази); L. luscina, Coprinus comatus, Crinipellis schevczenkovi (лаккази); Auriporia aureus, C. schevczenkovi, H. myxotricha, L. luscina, L. schimeji, Oxyporus obducens, S. litschaueri (ліпази); A. aureus, C. schevczenkovi, H. myxotricha, Hypsizygus marmoreus, L. luscina, L. schimeji, Pleurotus djamor, S. litschaueri (уреази) та L. luscina (нітрат редуктази). Виявлено нові штами базидіальних грибів Irpex lacteus K-1, Д-1, А-Дон-02 та Daedaleopsis confragosa f. confragosa AnSc-1 – активних продуцентів целюлозолітичних ензимів з яких  одержано 4 ензиматичні препарати целюлозолітичної дії. Для відібраних штамів базидіоміцетів вперше представлено закономірності синтезу екзоцелюлаз в живильне середовище залежно від умов культивування та складу середовища, а також вперше вивчено динаміку синтезу ензимів целюлозолітичного комплексу базидіоміцетами за умов тривалого культивування. Розроблено високоефективний спосіб отримання ферментних препаратів екзоцелюлаз, який завдяки елюції ферментів з субстрату культивування вперше дозволяє отримати повний комплекс ензимів. Застосування розробленого способу дозволяє в 3 етапи (висолювання білків – діаліз – гель-хроматографія) отримати ферментні препарати з високим ступенем очищення. Вперше проведено детальне порівняння ензимів целюлозолітичної дії, синтезованих базидіальними грибами, з комерційними ензиматичними препаратами целюлаз, які виробляються як на території України, так і поза її межами. З огляду на високу стабільність до дії температури, рН, здатність до гідролізу супутників целюлози та активність компонентів целюлозолітичного комплексу, препарати з базидіальних грибів є більш ефективними для комплексної переробки лігноцелюлозної сировини порівняно з комерційними препаратами “Ксибетен-Ксил” та “Ксибетен-Цел” (виробник – JSC «Biovet», Болгарія), “Celluclast 1,5L” (виробник – Sіgma, Німеччина), “Целюлаза” (виробник – Ензим, Україна) та лабораторним препаратом грибу Penicillium sp. Таким чином, результати досліджень ферментативної активності грибів свідчать про значний потенціал грибів до розкладання різноманітних органічних сполук.
В основі пріоритетних напрямів сучасних біотехнологій є вивчення можливості біоконверсії відходів для ефективного використання біоресурсів шляхом їх безвідходної переробки. Дослідження процесу культивування  30 видів вищих грибів на різноманітних субстратах  – відходах агропромислового комплексу – дозволило встановити нові альтернативні субстрати, перспективні для культивування вищих грибів. Вперше встановлена можливість використання СО_2-шротів для біоконверсії вищими грибами. За результатами скринінгу та показником біотрансформації широкого спектру субстратів (відходів олієекстракційної промисловості – шротів та жмихів; відходів макаронного та круп’яного виробництва − крупки; молочного виробництва − молочної сироватки) відібрано перспективні для біотехнологічного застосуванні види грибів: Coriolus (Trametes) versicolor, Ganoderma lucidum, Cordуceps sinensis, Pleurotus ostreatus. Високу біологічну ефективність біоконверсії субстратів встановлено для Agrocybe aegerita, Chaetoporellus aureus, Cordyceps sinensis, Flammulina velutipes, Ganoderma applanatum, Ganoderma lucidum, Fomes fomentarius, Lyophyllum schimeji, Pleurotus djamor, Pleurotus eryngii, Pleurotus ostreatus, та Schizophуllum commune.
Однією з важливих характеристик виду в культурі є його швидкість росту та вибагливість до поживних речовин середовища. Дослідження  росту культур за різних умов культивування дозволило отримати нові дані щодо штамоспецифічних особливостей культур за такими показниками, як морфологічна характеристика колоній, радіальна швидкість росту вегетативного міцелію, життєздатність вегетативного міцелію. Вперше отримано дані щодо життєздатності вегетативного міцелію штамів C. versicolor, G. lucidum, G. applanatum за високих температур інкубації (від 30 °С до 45 °С). Вивчення живильних потреб, впливу  кислотності живильного середовища, температури інкубування культур дозволило отримати необхідні відомості для створення наукового підґрунтя технології отримання грибної маси та оптимізації параметрів культивування грибів й синтезу корисних метаболітів. Вперше охарактеризовано динаміку росту та синтезу екзополісахаридів певних штамів G. applanatum і G. lucidum в умовах глибинного культивування на відходах харчової промисловості України − нативній молочній сироватці та крупці, описано морфологію їх ростових форм. За комплексом ознак відібрано штам лікарського гриба G. lucidum 1621~~,~~ перспективний для отримання біомаси, розроблено спосіб його культивування на нативній молочній сироватці. Вперше досліджено закономірності росту та утворення екзополісахаридів видами P. ostreatus, С. versicolor та  C. sinensis за умов використання живильного середовища на основі СО_2 – шроту амаранту. Вперше вивчено вплив цитратів металів на ріст і біосинтетичну активність C. versicolor. Розроблено принципову технологічну та апаратурну схеми отримання біомаси базидіального гриба Coriolus versicolor 353. За допомогою методів математичного планування теоретично розраховано та експериментально доведено оптимальний склад живильних середовищ для отримання посівного матеріалу та біосинтезу цільового продукту, що дозволяє збільшити концентрацію біомаси в 2,5 рази з одночасним зниженням вартості середовища в 1,8 разів. Створене наукове підґрунтя та розроблені технології отримання грибної маси та метаболітів з культуральної рідини спонукали нас до визначення їх біологічних властивостей і пошуку перспектив для біотехнологічного застосування.
	Досліджена біологічна цінність продуктів біоконверсії відібраними видами грибів. Встановлено, що біомаса C. sinensis 1928, C. versicolor 353,        G. lucidum 1621 та P. ostreatus 551 є джерелом цінних незамінних амінокислот та ненасичених жирних кислот, містить незначний рівень ліпідів, високий вміст білка та вуглеводів, встановлено наявність вітамінів та мінеральних елементів. Вперше виявлено антагоністичні властивості біомаси С. versicolor  проти грампозитивних бактерій: Bacillus licheniformis, Rhodococcus rhodochrous, Micrococcus luteus, Corynebacterium ammoniagens, Brevibacterium linens. Вперше встановлено, що пероральне введення інтактним мишам біомаси C. versicolor в дозі 2,6 мкг/г маси миші протягом 9 діб обумовлювало підвищення імунітету, що підтверджувалось активацією клітин фагоцитарної системи та збільшенням продукції ендогенного інтерферону в 1,6 рази. Вперше встановлена  противірусна дія культуральної рідини C. versicolor  по відношенню до складних вірусів: ДНК-геномного вірусу простого герпесу-1 і РНК-геномного вірусу везикулярного стоматиту в лікувальному режимі (інгібування репродукції на 1 lg ТЦД50). На основі показників хіміотерапевтичного індексу (ХТІ менше 4) висловлено припущення щодо дії компонентів культуральної рідини на рівні організму як коіндуктора ендогенного інтерферону. Проведено дослідження антиоксидантної активності (АОА) біомаси і культуральної рідини  C. versicolor  та G. lucidum. З’ясовано, що подовження експозиції культивування збільшувало АОА біомаси, водночас АОА культуральної рідини, навпаки, зменшувалась. Встановлено, що величина АОА спиртових екстрактів біомаси C. versicolor наближалась до рівня АОА аскорбінової кислоти. Аналіз даних обміну ліпідів щурів засвідчив можливість використання біомаси G. lucidum як біологічно активної добавки − продукту спрямованої дії для зниження холестерину і профілактики атеросклерозу. Встановлено високі показники сорбційної активності біомаси P. ostreatus  по відношенню до важких металів Pb^2+, Hg^2+, Cd^2+, що свідчить про можливість її використання в рецептурах функціональних продуктів як природній ентеросорбент з метою виведення важких металів із організму людини. Встановлені висока біологічна активність та цінність продуктів біоконверсії – біомаси та культуральної рідини грибів Coriolus versicolor, Cordyceps sinensis, Ganoderma lucidum, та Pleurotus ostreatus дають безперечно вагомі підстави рекомендувати їх для застосовування у функціональному харчуванні. 
Важливими й суттєвими характеристиками будь-якого інгредієнта у складі продуктів харчування є його стабільність, безпечність та виправданість використання. Встановлена на прикладі лікарського гриба Cordyceps sinensis наявність в складі біомаси та культуральної рідини унікального комплексу біологічно активних та цінних сполук, в тому числі: незамінних амінокислот та жирних кислот, вітамінів та ессенціальних елементів свідчить про доцільність та раціональність сумісного використання висушених біомаси та культуральної рідини у функціональному харчуванні. Отримані результати досліджень відсутності токсичності та патогенності міцеліальної маси та культуральної рідини C. sinensis відповідають вимогам нормативної документації на харчовий продукт, що підтверджується протоколом випробувань харчової продукції № 8/5936 від 24.11.2010 Інституту гігієни та медичної екології ім. О.М. Марзеєва Національної академії медичних наук України. Результати дослідження біохімічного складу міцеліальної маси та культуральної рідини C. sinensis після зберігання протягом 12 місяців свідчать про його стабільність. Встановлено, що обробка сирого міцелію та культуральної рідини C. sinensis перед сушкою аскорбіновою кислотою у концентрації  0,1М дозволяє зберігати 50,0-60,0 % вмісту каротиноїдів у ліпокаротиноїдному комплексі. Виявлені характеристики біомаси та культуральної рідини обумовили доцільність розроблення функціональних продуктів.
Вперше розроблено рецептури функціональних продуктів харчування: харчового концентрату − суп грибний (функціональний інгредієнт – біомаса та культуральна рідина C. sinensis, отримані в процесі біоконверсіії СО_2-шроту амаранту Amaranthus hybridus L.) та паштети (функціональний інгредієнт – біомаса P. ostreatus, отримана в процесі біоконверсіії СО_2-шроту амаранту Amaranthus hybridus L.) та виготовлені дослідні партії. Досліджено склад та функціонально-технологічні показники модельних паштетів. Доведено, що внесення біомаси гриба P. ostreatus до розроблених рецептур дозволяє отримати продукт з оптимальними органолептичними показниками, збалансований за хімічним складом; збагачений якісним складом амінокислот (особливо незамінними, необхідними для нормального функціонування людського організму) та здатний виводити важкі метали із організму людини.
Практичні результати досліджень та впровадження. За представленими у циклі робіт напрямами розроблено наступні нормативні документи: Технічні умови на харчову добавку на основі лікарського гриба Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc. (ТУ У 15.89.20.050-02128514-01-2010), Технологічна інструкція з отримання харчової добавки на основі гриба  Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc. (ТІ У15.89.20.050-02128514-01-2010), відповідність вимогам нормативної документації на харчовий продукт підтверджена протоколом випробувань висушеної біомаси та культуральної рідини Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc. № 815936 від 24.11.2010 р. Інституту гігієни та медичної екології ім. О.М. Марзеєва Національної академії медичних наук України. Технологія виготовлення харчової добавки на основі Cordyceps sinensis апробована ТОВ «МікотекФарм» (м. Київ). Рецептура харчового концентрату функціонального призначення − суп грибний – захищена патентом України на корисну модель № 69510. Запропонований спосіб культивування вищих базидіальних грибів роду Coriolus захищений патентом України на винахід №101751. Перспективні альтернативні субстрати для вирощування грибів захищені двома патентами України на корисну модель (№ 54524 та № 63646). Біомаси лікарських грибів отримані за запропонованими технологіями використані для отримання функціональних продуктів харчування: Coriolus versicolor та Ganoderma lucidum – на ВАТ ‹‹СБ МУР›› (м. Київ),  Pleurotus ostreatus – на кафедрі технології м’яса і м’ясних продуктів Національного університету харчових технологій апробовано технологію створення модельних паштетів з підвищеною харчовою цінністю. Розроблені високоефективні способи отримання целюлозолітичних препаратів із культуральної рідини базидіоміцетів захищені патентами України на корисну модель (№ 80795, № 82341, № 84836). На основі проведених досліджень розроблено 3 методичні рекомендації до виконання лабораторних робіт, матеріали використовуються при викладанні дисциплін «Основи мікології», «Основи клітинної технології у біології та медицині», «Біотехнологія сільськогосподарських виробництв» у Національному технічному університеті України «Київський політехнічний інститут». Результати роботи впроваджено у навчальний процес при викладанні курсів «Основи біотехнології», «Ферментологія» та «Основи мікології» на кафедрі фізіології рослин біологічного факультету Донецького національного університету.
Таким чином, роботи даного циклу поглиблюють знання про особливості росту макроміцетів та синтез екзоферментів грибами в культурі, біологічну цінність та активність біомаси грибів та їх культуральної рідини. Встановлені антибактеріальні, антиоксидантні, противірусні, імуномодулювальні властивості біомаси грибів та їх культуральної рідини, а також здатність до сорбції ними важких металів й зниження рівня холестерину, свідчать про високий потенціал біологічно активних речовин грибів. Створено наукове підґрунтя впровадження інноваційних технологій використання грибної маси з метою виробництва на її основі асортименту нових, якісних функціональних продуктів харчування для внутрішнього ринку України та експорту, що засвідчує затверджена технічна документація та випробування дослідних зразків продукції. Виявлена значна лігнолітична активність препаратів целюлаз базидіоміцетів і здатність до гідролізу сполук, супутніх целюлозі – пектину та крохмалю, свідчить на користь використання отриманих препаратів при комплексній переробці рослинної сировини. Запропоновано нові підходи та агенти для переробки відходів агропромислового комплексу та виробництва функціональних продуктів харчування. Результати представленого циклу робіт мають значення для вирішення гуманітарних проблем нашої країни шляхом покращення структури харчування населення та вирішення ряду екологічних проблем, раціонального використання біоресурсів шляхом їх безвідходної переробки. Окремі напрямки є пріоритетними не тільки для України, а і для світової науки.
Цикл наукових праць об’єднує публікації 2007-2013років. Результати роботи були представлені на міжнародних з’їздах, конференціях, конгресах. Загальна кількість публікацій авторів: 158, з них за темою циклу наукових праць – 98: 1 глава в колективній монографії, 35 статей (14 опубліковано в журналах, що входять до закордонних наукометричних баз даних), 8 патентів України, з них – 1 патент на винахід та 7 патентів на корисну модель, 52 тези доповідей та 3 методичні рекомендації. 

Автори:
старший науковий співробітник лабораторії
екстракції рослинної сировини та 
біоконверсії Державної установи «Інститут харчової 
біотехнології та геноміки Національної академії наук
України», к.б.н.                                                                       Т.А. Круподьорова

асистент кафедри промислової біотехнології 
Національного технічного університету України
«Київський політехнічний інститут», к.т.н.                            Л.О. Антоненко

молодший науковий співробітник,
асистент кафедри фізіології рослин біологічного
факультету Донецького національного університету               К.Г. Древаль